I "peptidi di difesa dell'ospite" (HDP) sono una componente importante del sistema immunitario innato degli animali, dove partecipano alla prevenzione e rimozione delle infezioni, uccidendo patogeni e tenendo sotto controllo i microbi commensali e/o stimolando altri componenti del sistema immunitario. Il programma di ricerca del gruppo si concentra sullo studio di come particolari caratteristiche che si sono evolute nelle loro sequenze e/o strutture determinano i loro modi d’azione, sia rispetto alle cellule batteriche sia rispetto a quelle dell’ospite. Questa conoscenza sono necessarie per poter progettare molecole basate su HDP a scopi biomedici o biotecnologici. Gli obiettivi della ricerca del gruppo sono:

• Individuare e caratterizzare HDP nei mammiferi,  anuri e organismi marini (in particolare appartenenti alla famiglia delle catelicidine e beta-defensine) e determinare come si sono evoluti per esplicare le loro funzioni.
• Indagare sulla relazione tra sequenza, caratteristiche chimico-fisiche, conformazione e tendenza all’aggregazione e i meccanismi d'azione rispetto alle cellule batteriche e animali.
• Utilizzare queste conoscenze per apportare modifiche razionali (es. variazioni nella loro struttura per migliorarne le caratteristiche farmacologiche, associazione con altre molecole antinfettive o con costrutti veicolanti) oppure per progettare peptidi antimicrobici artificiali basati sulle loro caratteristiche funzionali, per applicazioni biomediche o biotecnologiche.

Progetto 1: Identificazione, caratterizzazione ed evoluzione dei peptidi di difesa ospite

Tutti gli animali vertebrati esprimono almeno una catelicidina, e talvolta numerose catelicidine diverse fra loro. L’analisi di  database genomici, trascrizionali e proteici, utilizzando strumenti di bioinformatica, permette di identificare efficientemente nuovi membri della famiglia delle catelicidine, poiché anche se mostrano una notevole diversità di sequenze a livello del HDP stesso, sono dotati di pre-prosequenze e di una organizzazione genica ben conservate. Questo consente un efficiente estrazione delle loro sequenze dalle banche dati e loro inserimento in un database dedicato, creato ad hoc. Oltre a facilitare lo studio delle loro relazioni filogenetiche ed evolutive, l'analisi degli HDP così individuati, per quanto riguarda specifiche caratteristiche di sequenza e chimico-fisiche note per conferire una ppotente azione antimicrobica, permette di prevedere il potenziale antimicrobico e immunomodulatore. La sintesi chimica di peptidi selezionati consente quindi la verifica di tali caratteristiche funzionali. Questo richiede diversi metodi necessari per determinare la capacità dei peptidi sintetizzati d’interagire con e permeabilizzare le membrane biologiche, portando alla loro morte batterica, oppure di internalizzare nei batteri per colpire bersagli intracellulari. Lo studio dell’interazione con le cellule animali permette invece di comprendere la selettività dell’azione riguardo le potenziali attività citotossiche, e la capacità di modularle per favorire la risposta immunitaria. Questo processo consente di mettere in relazione particolari caratteristiche strutturali, che sono state naturalmente selezionate durante l’evoluzione degli HDP, con le specifiche caratteristiche funzionali dei peptidi.

Gli obiettivi della ricerca sono essenzialmente quelle di ottenere una migliore comprensione i) del ruolo di HDP come le catelicidine nelle risposta immunitaria dell'uomo e di altri animali, e ii) di come queste molecole possono essere alterate o riprogettate per applicazioni biotecnologiche o biomediche.

Progetto 2:  Fattori strutturali che definiscono gli effetti dei peptidi di difesa dell'ospite su cellule microbiche o cellule dell’ospite

Gli HDP possono agire sia a livello della parete cellulare si in modo intracellulare. Molti agiscono danneggiando la membrana batterica, a concentrazione micromolare, mediante la formazione di pori o di altri tipi di lesioni. Alcuni HDP sono in grado di oltrepassare la membrana senza danneggiarla, e inattivare bersagli citoplasmatici, e talvolta sono in grado d’utilizzare entrambe questi meccanismi a secondi della loro concentrazione. Gli HDP possono anche danneggiare le membrane delle cellule animali (effetti citotossici), ma normalmente a concentrazioni ben più elevate di quelle antimicrobiche, mentre a concentrazioni minori possono stimolare le cellule dell’ospite interagendo con recettori di membrana o interni (portando ad effetti di stimolo quali proliferazione, chemiotassi e/o degranulazione). Lo studio di queste molteplici diverse funzioni porterà a una migliore comprensione del ruolo degli HDP nelle risposte immunitarie, e potenzialmente al loro utilizzo terapeutico. Il gruppo sta sistematicamente studiando i ruoli biologici di specifici HDP, principalmente il peptide LL-37 derivato dalla catelicidina umana, e i suoi ortologhi in altri primati, e alcuni PrAMP (HDP ricchi in prolina derivati dalle catelicidine presenti nei cetartiodattili), modificandoli razionalmente con alterazioni minimali ma mirate delle sequenze.  Questo ci permette di determinare quali sono le principali caratteristiche che permettono loro di interagire con, ed alterare le membrane biologiche, e la modalità con le quali questi processi avvengono, portando direttamente alla morte batterica, oppure alla traslocazione per colpire bersagli interni.

A tal fine, si utilizza un'ampia gamma di metodi sintetici, biofisici e biochimici, quali la sintesi in fase solida di peptidi, utilizzando anche amminoacidi non naturali, studi spettroscopici con CD e fluorescenza per seguire le loro interazioni intermolecolari e come queste dipendono dalla loro struttura, la risonanza plasmonica di superficie per studiare l’interazione con membrane modello, e la citometria a flusso e vari saggi microbiologici per definire i loro effetti cellulari e citotossici.

(A. Tossi, S. Pacor in collaborazione con M. Scocchi, M. Mardirossian, P. Cescutti e C. Lagatolla)

Progetto 3. Ridisegno razionale e ottimizzazione degli HDP

Si ritiene che gli HDP abbiano un elevato potenziale quali lead-compound per lo sviluppo di agenti anti-infettivi con meccanismi d’azione diversi dagli antibiotici convenzionali. Tenendo conto della notevole attività contro ceppi batterici anche multi-resistenti a farmaci, e della scarsa tendenza a suscitare a loro volta resistenza, potrebbero contribuire a risolvere il crescente problema del drug-resitance nei batteri patogeni. Tuttavia, sono poco adatti per uso sistemico a causa della bassa biodisponibilità e indici terapeutici spesso insufficienti. La modifica razionale e knowledge-based delle loro sequenze e strutture può portare non solo ad una migliore conoscenza dei loro modi d’azione, ma  indicare modifiche necessarie per renderli utili a specifici scopi terapeutici.

• L'ottimizzazione delle dimensioni e delle caratteristiche chimico-fisiche possono consentirne un’applicazione economicamente conveniente per trattamenti topici delle infezioni, o per prevenire la contaminazione di dispositivi biomedici da parte di patogeni multiresistenti.
• La funzionalizzazione di HDP poco tossici ad azione interna, con molecole o costrutti non-amminoacidi, può permettere di seguire la loro traiettoria dallo spazio extracellulare alla superficie cellulare e allo spazio intracellulare, e potenzialmente consentirne l’utilizzo come agenti veicolanti per altre sostanze antibatteriche poco permeanti per batteri.
• La coniugazione di HDP o loro derivati ​​a nano costrutti di diverso tipo può aumentarne la stabilità e tempo di vita in vivo, ridurne la citotossicità e permettere una migliore distribuzione ai siti d’infezione.

L'implementazione di queste modifiche beneficia dalle conoscenze raccolte sulle caratteristiche funzionali degli HDP e dati di SAR ottenuti negli altri progetti del gruppo, e da una lunga esperienza con la sintesi in fase solida, modificazione e coniugazione dei peptidi.

(A. Tossi e S. Pacor in collaborazione con A. Caporale, ospite CNR e Milena Guida, esperto ospite)