L’attività del gruppo di ricerca è finalizzata all’identificazione di metodi per potenziare la capacità rigenerativa del muscolo scheletrico. In particolare, il gruppo di ricerca studia il ruolo dell’attività elettrica e dei fattori trofici locali che caratterizzano il microambiente e la nicchia delle cellule satelliti, ovvero le cellule muscolari progenitrici responsabili della miogenesi postnatale. In particolare, viene studiato il ruolo dei fattori di adesione nella determinazione della capacità di proliferazione e di differenziamento delle cellule satelliti mediante la sintesi di matrici extracellulari ricombinanti. Inoltre, sono investigati i meccanismi molecolari responsabili del controllo dalla capacità rigenerativa del muscolo scheletrico analizzando il processo della miogenesi in vitro, mediante l’impiego di colture primarie di cellule satelliti (murine e umane) e linee cellulari miogeniche. Gli approcci sperimentali utilizzati includono: la stimolazione elettrica di campo, l’elettrofi

siologia, tecniche di biochimica e di sintesi di proteine della matrice, l’immunofluorescenza e la videomicroscopia.

L’obiettivo finale è la messa a punto di nuove strategie per contrastare la riduzione della capacità funzionale del muscolo scheletrico durante l’invecchiamento e nelle patologie riguardanti l’apparato neuromuscolare.

Attualmente, le principali linee di ricerca sono quattro.

1) Interazione tra recettori adenosinici e acetilcolinici

L’attività di modulazione dell’adenosina sui neurorecettori ionotropici e metabotropici è ben documentata a livello del sistema nervoso centrale e periferico. Ad esempio, è noto che l’adenosina controlla l’attività dei recettori acetilcolinici nicotinici mediante un processo di fosforilazione AMPc-dipendente.

Molti tipi di recettori adenosinici sono espressi durante il differenziamento dei precursori miogenici e nelle fibre muscolari, tuttavia poco è noto sul ruolo di controllo dell’adenosina e dei recettori adenosinici sull’attività del recettore acetilcolinico nicotinico muscolare (AChR).

Con questo progetto, il gruppo di ricerca si propone di studiare gli effetti dell’attivazione dei recettori adenosinici sulle proprietà biofisiche del AChR embrionale (gamma-AChR), responsabile del controllo della sinaptogenesi e delle miogenesi, e del AChR adulto (epsilon-AChR), responsabile della trasmissione neuromuscolare.

I risultati della ricerca oltre a rappresentare un progresso della conoscenza del processo di trasmissione neuromuscolare e della plasticità sinaptica, potrebbero consentire di identificare nuove strategie farmacologiche per il trattamento di patologie neuromuscolari caratterizzate da una compromissione della comunicazione nervo-muscolo.

Distributione delle due isoforme di AChR nelle fibre muscolari scheletriche

2) Ruolo dell’agrina neuronale nell’invecchiamento del muscolo

Durante l’invecchiamento vi è una progressiva riduzione della massa e della forza sviluppata dal muscolo scheletrico (sarcopenia). La graduale riduzione del numero delle fibre muscolari scheletriche inizia durante la quinta decade e raggiunge il 50% nella nona decade di vita. Risultati recenti suggeriscono che una delle cause della sarcopenia è la disregolazione dei fattori trofici locali e sistemici. Nonostante se ne riconosca l’importanza, il contributo dei fattori neurotrofici, e dell’agrina neuronale in particolare, è tuttora poco studiato. Il gruppo di ricerca ha già pubblicato alcuni risultati che dimostrano che l’agrina neuronale promuove il differenziamento delle cellule satelliti umane.

Con questo progetto, ci si propone di studiare i possibili effetti del fattore neurotrofico sulla capacità proliferativa dei precursori miogenici nell’uomo.

Studi demografici indicano che la sarcopenia raggiungerà proporzioni epidemiche tra pochi anni. Pertanto, la compromissione funzionale dell’apparato muscoloscheletrico nell’anziano, e la riduzione della qualità della vita che ne consegue, rappresenta un importante problema sociale. L’obiettivo del progetto risponde alla necessità di identificare dei meccanismi molecolari in grado di potenziare la capacità rigenerativa delle cellule satelliti per prevenire e/o contrastare il fenomeno della sarcopenia nella terza età.

Figura tratta da Lorenzon et al, 2004, Exp Gerontol 39:1545-1554

3) La stimolazione elettrica come strategia di potenziamento della rigenerazione del muscolo scheletrico

Il muscolo scheletrico produce specie reattive dell’ossigeno (ROS) in modo attività-dipendente. In particolare, durante l’esercizio fisico intenso, si instaura uno sbilanciamento tra la produzione delle ROS ed i sistemi antiossidanti del muscolo scheletrico. Lo stress ossidativo che ne risulta è riconosciuto come una delle cause della ridotta capacità rigenerativa delle cellule satelliti. Tuttavia, secondo il principio dell’ormesi, basse concentrazioni delle ROS hanno azione protettiva sulle capacità miogeniche delle cellule satelliti, promuovendone proliferazione e differenziamento.

La stimolazione elettrica di campo consente lo studio del livello delle ROS prodotte a livello delle singole fibre muscolari. Il gruppo di ricerca ha recentemente sviluppato un bioreattore che consente la stimolazione elettrica di campo di precursori miogenici murini ed umani. Mediante l’impiego del bioreattore, ci si propone di identificare protocolli di stimolazione elettrica in grado di indurre nelle cellule muscolari livelli “permissivi” delle ROS.

Scopo finale del progetto è lo sviluppo di protocolli di stimolazione ed elettrostimolatori innovativi da impiegare durante il percorso riabilitativo di pazienti con patologie caratterizzate da una compromissione della funzionalità muscolare.

Figura tratta da Sciancalepore et al, 2012, Free Radic Biol Med 53:1392-1398

4) Il controllo della matrice extracellulare sulla formazione del muscolo: i polipeptidi umani elastino-simili come substrati biomimetici per la rigenerazione muscolare

Lo sviluppo funzionale del muscolo scheletrico dipende in modo cruciale dalla matrice extracellulare che ne garantisce l’organizzazione spaziale, il supporto strutturale e la funzione meccanica. La connessione tra la matrice e il citoscheletro, mediata dai complessi di adesione cellulare, è essenziale per stabilizzare la membrana della cellula muscolare durante la contrazione. Il fatto che mutazioni capaci di alterare le relazioni tra cellule e matrice portino invariabilmente alla perdita della funzione contrattile e del muscolo stesso, evidenziano in maniera drammatica il ruolo cruciale di queste interazioni. Nelle strategie di rigenerazione muscolare, l’obiettivo di riprodurre la struttura e le funzioni della matrice extracellulare comporta la sintesi di substrati di adesione artificiali in grado di favorire le proprietà e le funzioni fisiologiche del tessuto. Nel nostro laboratorio sono state sintetizzate proteine ricombinanti derivate dall’elastina umana (Human Elastin-Like Polypeptides, HELPs).

Proprietà interessante di queste proteine è la loro struttura modulare, che permette la fusione di domini bioattivi derivati da altre proteine allo scheletro polipeptidico dell’elastina: in questo modo è possibile conferire specifiche funzionalità alla proteina ricombinante. Le proteine HELP, utilizzate come supporti di coltura per i mioblasti C2C12, stimolano l’adesione cellulare, la proliferazione, lo sviluppo miogenico e la comparsa precoce del meccanismo di accoppiamento eccitazione-contrazione. Nell’insieme, le proteine HELP si sono rivelate un ottimo strumento per la studio delle relazioni struttura/funzione coinvolte nella biologia delle cellule del muscolo scheletrico e possono essere considerate dei prototipi per nuovi biomateriali da impiegare nella rigenerazione muscolare. L’obiettivo a lungo termine del progetto è quello di produrre uno scaffold tridimensionale con proteine HELP variamente funzionalizzate in grado di mimare le proprietà biochimiche e meccaniche del microambiente che circonda le cellule satellite, in maniera da migliorarne la sopravvivenza cellulare attraverso il contrasto all’azione di segnali degenerativi indotti dall’età o da patologie.

Figura: Calcium imaging di mioblasti C2C12 durante il differenziamento in vitro. Le cellule, adese a una delle proteine HELP, mostrano transienti di calcio indotti da depolarizzazione (K+ 60mM) o da caffeina (20mM). Modificato da D’Andrea et al, 2015, Biomaterials, 67:240-253