La distribuzione spaziale e l’organizzazione su scala nanometrica dei recettori di membrana svolgono un ruolo cruciale nella regolazione delle loro interazioni, del clustering e dei processi di segnalazione a valle. Tuttavia, nonostante la loro rilevanza per la funzione cellulare e per lo sviluppo delle malattie, i meccanismi attraverso cui l’organizzazione dei recettori viene regolata spazialmente all’interno del complesso ambiente della membrana cellulare rimangono ancora in larga parte inesplorati, principalmente a causa delle limitazioni degli attuali approcci sperimentali. In particolare, una questione importante e tuttora irrisolta riguarda il modo in cui l’organizzazione e le interazioni dei recettori siano influenzate dalla loro localizzazione all’interno di domini specializzati della membrana, quali i lipid rafts.

Il progetto si propone di fare luce su questo “black box” attraverso lo sviluppo di una piattaforma innovativa basata sulle nanotecnologie del DNA per lo studio dei nanoambienti dei recettori di membrana e della loro organizzazione spaziale, con particolare attenzione ai lipid rafts. Al centro della piattaforma vi è RepliSeq, uno strumento basato sul DNA che utilizza nanostrutture modulari a simmetria radiale per decodificare l’organizzazione spaziale delle proteine di membrana attraverso una lettura basata sul sequenziamento del DNA.

Combinando RepliSeq con tecniche biofisiche complementari, tra cui la Surface Plasmon Resonance (SPR) e la spettroscopia infrarossa su scala nanometrica (NanoIR), insieme ad approcci di microscopia elettronica quali la microscopia elettronica ad alta risoluzione (EM) e la microscopia a fascio ionico focalizzato (FIB), nonché a tecniche avanzate di imaging, il progetto mira a definire come i processi di oligomerizzazione e i pattern di interazione dei recettori siano organizzati spazialmente, come siano correlati ai nanoambienti dei lipid rafts e come cambino in diversi stati cellulari e in risposta a trattamenti. Nel complesso, questo approccio integrato potrebbe consentire di identificare nuove firme molecolari associate alla malattia e alla risposta terapeutica.

Il nostro laboratorio sfrutta la programmabilità, la modularità e la precisione su scala nanometrica uniche delle nanostrutture di DNA per sviluppare strumenti innovativi volti allo studio di meccanismi cellulari fondamentali coinvolti nelle patologie, con particolare riferimento al cancro. In precedenza, abbiamo sviluppato NanoDeep, un approccio di “DNA microscopy” nel quale il DNA funge da proxy molecolare per il rilevamento delle proteine, consentendo di analizzare la prossimità tra proteine attraverso il sequenziamento del DNA (Ambrosetti et al., Nature Nanotechnology 2021, 16, 85–95). Stiamo ora ampliando questo concetto sfruttando la straordinaria versatilità strutturale delle nanostrutture di DNA 2D e 3D, passando dallo studio della prossimità tra proteine alla caratterizzazione dell’organizzazione spaziale dei cluster proteici su scala nanometrica.

In particolare, le nanostrutture planari poligonali di DNA (Flat Sheets, FS) costituiscono un sistema altamente modulare e programmabile, nel quale la disposizione radiale dei siti di legame consente di rilevare proteine posizionate a distanze definite rispetto a un punto di riferimento centrale. Questa strategia innovativa trasforma le nanostrutture di DNA in veri e propri “righelli molecolari programmabili”, offrendo un approccio potente e concettualmente nuovo per decodificare l’architettura su scala nanometrica delle proteine di membrana e studiare come la loro organizzazione spaziale cambi in condizioni fisiologiche e patologiche.

Stiamo inoltre sviluppando sistemi di membrana artificiali basati su supported lipid bilayers (SLB). Tra i diversi approcci disponibili per la formazione di SLB, abbiamo selezionato il metodo della fusione di vescicole, utilizzando le Giant Unilamellar Vesicles (GUV) come sistema di partenza, poiché consentono di ottenere un ambiente lipidico ben controllato e mimetico delle condizioni cellulari. Le GUV possono infatti rompersi e distribuirsi sulla superficie di substrati solidi, formando doppi strati lipidici omogenei.

Per ottimizzare la produzione di GUV per questa applicazione, stiamo collaborando con CNR-IOM (Trieste) allo sviluppo di un dispositivo dedicato per l’elettroformazione, basato su elettrodi interdigitati in oro. L’attività è finalizzata a studiare l’effetto dei diversi parametri di elettroformazione sulla morfologia delle vescicole, sulla distribuzione dimensionale e sull’omogeneità della popolazione, con l’obiettivo di definire condizioni riproducibili per la generazione di GUV idonee alla successiva formazione di SLB e allo studio dei sistemi di membrana.