Il programma di ricerca coordinato è focalizzato sulla farmacologia traslazionale in ambito pediatrico, con particolare attenzione alle strategie di personalizzazione della terapia. Puntiamo a contribuire alla comprensione dei meccanismi molecolari e cellulari che influenzano la risposta ai farmaci nei pazienti pediatrici. La consolidata collaborazione con l'Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) Materno Infantile Burlo Garofolo di Trieste costituisce un elemento cardine della nostra attività di ricerca. Tale collaborazione facilita lo sviluppo di progetti traslazionali di rilevanza concreta per l'ottimizzazione dei protocolli terapeutici pediatrici.
Con una combinazione di approcci farmacocinetici, farmacodinamici e farmacogenomici e di modelli in vitro, il gruppo studia il ruolo e l'interconnessione di queste caratteristiche e la loro associazione con la risposta dei pazienti alla terapia.
Sviluppo di modelli in vitro paziente-specifici per la personalizzazione della terapia
Le ipotesi molecolari generate sulla base delle osservazioni fatte nei pazienti sono verificate in vitro, per ottenere informazioni sui meccanismi cellulari e molecolari alla base dei fenomeni clinici rilevanti e per migliorare ulteriormente la pratica clinica.
Attualmente, questi esperimenti in vitro sono focalizzati sullo sviluppo di modelli farmacologici innovativi basati sulle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) e sugli organoidi intestinali.
Le iPSCs sono ottenute riprogrammando le cellule somatiche dei pazienti in uno stato simile all'embrione mediante l'espressione forzata di geni selezionati; queste cellule mantengono il patrimonio genetico dei donatori, permettendo dunque la generazione di modelli personalizzati. La pluripotenza delle iPSCs, che rende possibile il differenziamento di queste cellule in tutti i tessuti dell’organismo umano mediante appropriate condizioni di coltura, consente di ottenere linee cellulari altrimenti non facilmente accessibili da soggetti umani, tra cui quelle pancreatiche. I progressi nella tecnologia delle iPSCs creano nuove possibilità per modellare le malattie e per controllare gli effetti avversi dei farmaci in un modo personalizzato. In particolare, il punto focale della nostra attuale ricerca in questo ambito è basato sulla generazione del pancreas esocrino, sia bidimensionale che tridimensionale, a partire da iPSCs, al fine di studiare la pancreatite indotta da farmaci.
Gli organoidi intestinali sono invece generati a partire da biopsie intestinali da cui è possibile isolare le cripte in cui sono localizzate le cellula staminali adulte. Grazie alla coltivazione delle cellule staminali adulte è possibile generare strutture 3D intestinali che conservano il background genetico ed epigenetico del paziente. Al momento sono in corso diversi progetti sugli organoidi intestinali di pazienti pediatrici affetti da MICI al fine sia di identificare nuove terapie farmacologiche per il trattamento di queste patologie sia per indagare sui meccanismi d’azione dei farmaci attualmente impiegati in clinica.
Immunofluorescenza effettuata sugli organoidi pancreatici esocrini derivati dale iPSCs. A) Nuclei colorati in blu col DAPI; B) Amilasi pancreatica colorata in rosso; C) Citocheratina-19 colorata in verde; D) Merge.
Farmacogenetica e farmacoepigenetica nelle malattie infiammatorie croniche intestinali pediatriche
Le MICI sono caratterizzate da un'infiammazione idiopatica cronica intestinale e comprendono due principali disturbi: malattia di Crohn e rettocolite ulcerosa. Il picco di insorgenza di MICI è nelle persone di età compresa tra 15 e 30 anni; tuttavia, l'insorgenza della malattia nei pazienti pediatrici è frequente e un aumento dei tassi di incidenza a livello globale sono stati dimostrati sia nei paesi sviluppati che in via di sviluppo, costituendo una vera epidemia nei bambini. Al momento, non esiste una terapia curativa per queste malattie, ma molti farmaci immunosoppressori sono attualmente impiegati.
I glucocorticoidi vengono somministrati per indurre la remissione, mentre gli antimetaboliti tiopurinici azatioprina e mercaptopurina sono efficaci per mantenere la remissione.
Per i glucocorticoidi, l'efficacia di questi farmaci è molto variabile e gli effetti collaterali, particolarmente gravi nei pazienti pediatrici, sono comuni e spesso imprevedibili: la comprensione della regolazione genica complessa mediata dai glucocorticoidi potrebbe far luce sulle cause di questa variabilità. In questo contesto, le caratteristiche epigenetiche, come i profili di espressione di RNA non codificante o i profili di metilazione del DNA rappresentano un campo di ricerca di nostro interesse.
Per l'azatioprina, la ricerca attuale considera l’identificazione di nuovi meccanismi d’azione e nuovi target cellulari quali l’epitelio intestinale. Nuove pathways coinvolte nell’efficacia delle tiopurine, tra cui l’autofagia e la via di STING, sono in corso di studio.
Le variabili farmacogenomiche considerate nelle MICI sono polimorfismi a singolo nucleotide nei geni coinvolti nella biotrasformazione della mercaptopurina come TPMT, o nella farmacodinamica tra cui PACSIN2 e ATG16L1.
Tra i marcatori farmacodinamici più promettenti e innovativi in fase di studio vi sono le vescicole extracellulari dalle quali isoliamo e quantifichiamo miRNA candidati associati alla risposta alle tiopurine.
L’integrazione delle diverse misurazioni farmacologiche (farmacogenetiche, farmacocinetiche e farmacodinamiche) con la loro risposta alla terapia, ha lo scopo di fornire ai medici gli strumenti per adattare al meglio il trattamento alle caratteristiche individuali dei pazienti.
Approcci farmacologici per la personalizzazione della terapia della sindrome nefrosica (SN)
La SN è una malattia renale infantile causata da una compromissione della funzione glomerulare che si presenta tipicamente nella prima decade di vita. I glucocorticoidi sono considerati la terapia di prima linea della SN infantile idiopatica e sono in grado di indurre la remissione nel 90-95% dei pazienti. La reattività ai glucocorticoidi alla diagnosi è di grande importanza prognostica per quanto riguarda la funzionalità renale, che è generalmente ben conservata nelle SN sensibili a questi farmaci. Casi di SN resistenti ai glucocorticoidi, primarie e secondarie, sono osservate rispettivamente nel 5-10% e nell'1-3% dei bambini e questi pazienti sono soggetti a malattia progressiva e insufficienza renale. Anche le recidive sono comuni nei bambini; i pazienti pediatrici con malattia recidivante sono a rischio di gravi complicazioni.
Sono stati fatti molti sforzi per prevedere la risposta ai glucocorticoidi nei bambini con SN per evitare terapie farmacologiche inutili ed effetti collaterali, ma con risultati contrastanti.
L'obiettivo principale di questa ricerca è la valutazione del ruolo delle caratteristiche farmacogenomiche coinvolte farmacodinamica dei glucocorticoidi nella risposta alla terapia steroidea nei pazienti pediatrici con SN trattati con un protocollo standardizzato. Tali caratteristiche includono profili epigenetici, in particolare la metilazione del promotore del gene NLRP3 e l’espressione dei lncRNA GAS5 e GAS5-AS1. Queste analisi porteranno all'identificazione di marcatori genetici utili, che permettano di prevedere a priori l'efficacia e della terapia steroidea.
Personalizzazione terapeutica nell'artrite idiopatica giovanile (AIG): marcatori molecolari e risposta al metotrexato (MTX)
Per i bambini con AIG che non rispondono all’antimetabolita MTX, il ritardo nell'identificazione del trattamento ottimale in uno stadio precoce della malattia può portare a danni articolari irreversibili.
In questo contesto, l'obiettivo primario è identificare marcatori predittivi utili nel predire l'efficacia del MTX, così da indirizzare tempestivamente i pazienti con AIG con minori probabilità di risposta al farmaco verso terapie più aggressive con farmaci biologici.
A questo scopo, studi in vitro volti a indagare il meccanismo d’azione del MTX permetteranno di individuare nuovi marcatori di efficacia, tra cui, ad esempio, polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) in geni candidati. Inoltre, recenti evidenze suggeriscono un possibile ruolo dei long non-coding RNA (lncRNA) nel meccanismo d’azione del farmaco. In particolare, il lincRNA-p21 è noto per la sua interazione con p53 e per la sua capacità di modulare la risposta infiammatoria attraverso la regolazione di NF-κB. Gli studi in vitro permetteranno di approfondire il meccanismo alla base dell’azione di questo lncRNA sia in linee cellulari immortalizzate rappresentative della patologia che nelle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) dei pazienti. In seguito, la validazione di questi marker avverrà nei pazienti attraverso la correlazione con la risposta clinica al MTX, valutata tramite indici di attività della malattia, quali il Juvenile Arthritis Disease Activity Score (JADAS), l’American College of Rheumatology Pediatric(ACRped) e il raggiungimento della remissione clinica. In questo modo verranno identificati nuovi marcatori predittivi di risposta al MTX, che permetteranno di ottimizzare il percorso terapeutico nei pazienti con AIG e migliorare la gestione della malattia.
Schematizzazione dei meccanismi d’azione del MTX; l’inibizione della sintesi de novo di purine e pirimidine attraverso l'inibizione della diidrofolato reduttasi (DHFR) e della timidilato sintasi (TYMS); induzione del lincRNA-p21 e suo legame all’mRNA della subunità p65 di NF-κB, in seguito all'attivazione della protein chinasi DNA-dipendente (DNA-PK) e di p53; incremento del rilascio di adenosina per inibizione dell'AICAR trasformilasi (ATIC), con conseguente attivazione dei recettori dell’adenosina A2A (ADORA2A), responsabili dell'effetto antinfiammatorio.
Vescicole extracellulari neuronali circolanti: biomarcatori predittivi degli effetti avversi della ketamina
La ketamina è un anestetico dissociativo, antagonista non competitivo del recettore dell’N-methyl-D-aspartato (NMDA) che blocca l’effetto eccitatorio del glutammato. Riduce quindi l’eccitazione sinaptica mediata dai recettori NMDA nel sistema nervoso centrale con conseguente azione anestetica e analgesica. La ketamina è un farmaco presente nell’armamentario terapeutico del pediatra che si occupa di analgosedazione procedurale del bambino al di fuori della sala operatoria. Come tutti i farmaci, la ketamina può indurre degli effetti collaterali. Gli effetti collaterali più frequentemente registrati durante sedazione procedurale al di fuori della sala operatoria, dopo somministrazione di ketamina, sono il vomito e l’agitazione post-sedazione. L’obiettivo dello studio è quello di valutare la presenza di miRNA isolati da vescicole extracellulari plasmatiche originate dal sistema nervoso centrale, che possano associarsi allo sviluppo di vomito o agitazione post-sedazione. In aggiunta, lo studio prevede anche l’utilizzo di modelli neuronali personalizzati derivati dal differenziamento di iPSCs paziente-specifiche; questi modelli verranno utilizzati per investigare ulteriormente il ruolo dei miRNA nel predisporre i pazienti allo sviluppo dell’agitazione post-sedazione e del vomito indotti da ketamina.
Vescicole extracellulari di origine neuronale isolate dal plasma dei pazienti. A) Microscopia elettronica a trasmissione: vista d'insieme e dettaglio ingrandito. Scala di riferimento = 100 nm. B) Immagine rappresentativa e ingrandimento di una vescicola neuronale tramite ONI (Nanoimager) con quantificazione della distribuzione delle tetraspanine (doi: 10.1002/cpt.3420).
Neuropatia periferica indotta da talidomide
La talidomide è un farmaco con proprietà immunomodulanti e antiangiogenetiche, impiegato nel trattamento dell'eritema nodoso lebbroso, del mieloma multiplo e nelle malattie infiammatorie croniche intestinali (MICI) in pazienti refrattari alle terapie convenzionali. Tuttavia, l’uso prolungato del farmaco è spesso limitato dall’insorgenza della neuropatia periferica (TiPN), la principale reazione avversa al farmaco e una delle cause più comuni di interruzione del trattamento.
Considerata la patogenesi ancora poco chiara della TiPN, lo studio utilizza iPSCs derivate da pazienti pediatrici con MICI, stratificati in base alla presenza o assenza di TiPN, per generare neuroni sensoriali, utili allo studio dei meccanismi molecolari e cellulari alla base di questa reazione avversa al farmaco. Questi modelli cellulari verranno utilizzati per approfondire il ruolo di ADAMTS2 e CELSR2, due geni identificati come downregolati negli studi preliminari di trascrittomica condotti dal gruppo di ricerca su PBMC di pazienti con MICI e sulla linea cellulare SHSY-5Y trattata con il farmaco.
Sicurezza ed efficacia di terapie innovative per pazienti pediatrici affetti dalla sindrome di Aicardi Goutières utilizzando modelli paziente-specifico.
La sindrome di Aicardi-Goutières (AGS) è una malattia genetica rara, classificata come immunodeficienza primaria con esordio in epoca neonatale e nella prima infanzia. Clinicamente, i pazienti con AGS presentano manifestazioni immunitarie, degenerazione dello sviluppo neurologico e disturbi progressivi con conseguente scarsa aspettativa di vita. L'AGS ha un fenotipo altamente eterogeneo ed è caratterizzata da un accumulo anomalo di acidi nucleici endogeni che innescano una aberrante risposta immunitaria mediata dall’interferone (IFN), (che si traduce in una un'interferonopatia distruttiva). Ad oggi, i trattamenti farmacologici sono parzialmente efficaci e principalmente di supporto. Obiettivo dello studio è di generare cellule staminali neurali (NSC) e neuroni a partire dalle iPSCs paziente specifiche per lo screening in vitro dell'efficacia e della sicurezza di terapie convenzionali e potenzialmente innovative per AGS.
