I "peptidi di difesa dell'ospite" (HDP) sono una componente importante del sistema immunitario innato degli animali, dove partecipano alla prevenzione e rimozione delle infezioni, uccidendo i patogeni e / o stimolando altri componenti del sistema immunitario. Il nostro programma di ricerca si concentra sullo studio di come particolari caratteristiche che si sono evolute nelle loro sequenze e/o strutture determinano le loro modalità d’azione sia sulle cellule batteriche sia su quelle dell’ospite. Questa conoscenza può essere utilizzata per aiutare a progettare molecole basate su HDP per applicazioni biomediche e biotecnologiche. Gli obiettivi della ricerca del gruppo sono:

- Individuare e caratterizzare HDP nei mammiferi, rane e organismi marini (in particolare catelicidine e defensine) e identificare significative caratteristiche evolutive.

- Indagare sulla relazione tra queste caratteristiche (ad es. sequenza, caratteristiche chimico-fisiche, conformazione, tendenza all’aggregazione) e i meccanismi d'azione rispetto alle cellule dell’ospite o batteriche.

- Utilizzare queste conoscenze per razionalmente modificare gli HDP (es. variare la sequenza, associarli ad antibiotici convenzionali o a nanparticelle) o progettare AMP artificiali de-novo per applicazioni biomediche o biotecnologiche.

Progetto 1: Identificazione, caratterizzazione ed evoluzione dei peptidi di difesa ospite

Tutti gli animali vertebrati esprimono numerose beta-defensine e almeno una catelicidina. L’analisi di  database genomici, trascrizionali e proteici, utilizzando strumenti di bioinformatica, permette di identificare nuovi HDP e in particolare membri della famiglia delle catelicidine. Sebbene questi peptidi mostrino una notevole diversità di sequenze a livello del HDP, hanno pre-prosequenze e un organizzazione genica ben conservate che consentono un efficiente estrazione di sequenze. L’inserimento delle nuove sequenze in un database dedicato che assiste nello studio delle loro relazioni filogenetiche e dell'evoluzione. L'analisi delle sequenze e di specifiche caratteristiche chimico-fisiche del dominio HDP (ad esempio caratteristiche di carica e idrofobicità) possono poi essere utilizzati per prevedere il potenziale antimicrobico e immunomodulatore. La sintesi chimica di peptidi selezionati consente quindi la caratterizzazione delle caratteristiche funzionali (capacità di interagire con le membrane o internalizzarsi in batteri, tipo e gravità delle lesioni causate nelle membrana biologiche,  attività intracellulari, ecc.) e di convalidare e perfezionare la previsione originale. Questo processo consente di mettere in relazione particolari caratteristiche strutturali, che sono state naturalmente selezionate durante la loro evoluzione, con le specifiche caratteristiche funzionali dei peptidi.

Questa informazione porta a i) una migliore comprensione del ruolo delle cathelicidine nelle risposte immunitarie dell'uomo e di altri animali, e ii) la valutazione di ciò che può essere alterato o deve essere mantenuto nella riprogettazione dei peptidi o nella progettazione di molecole artificiali biotecnologiche o biomediche utilizza.

(A. Tossi, in collaborazione con  A. Pallavicini e M Gerdol, e con Dennis Prickett come esperto ospite)

Progetto 2:  Fattori strutturali che definiscono gli effetti dei peptidi di difesa dell'ospite su cellule microbiche o cellule dell’ospite

Gli HDP possono agire sia a livello cellulare che intracellulare. Nel caso di batteri, spesso agiscono danneggiando la membrana a concentrazione micromolare (mediante formazione di pori o altri tipi di lesioni) oppure internalizzano e inattivano target citoplasmatici, o utilizzano entrambe questi meccanismi. Ad concentrazione più elevata possono danneggiare anche le cellule animali (effetti citotossici) in modo simile, mentre alle più basse concentrazioni antimicrobiche possono stimolare le cellule dell’ospite interagendo con recettori di membrana o interni (portando ad effetti di stimolo quali proliferazione, chemiotassi e/o degranulazione). Una migliore conoscenza di queste diverse funzioni porterà a una migliore comprensione del ruolo degli HDP nelle risposte immunitarie, e potenzialmente al loro sfruttamento terapeutico. Stiamo sondando i ruoli biologici di specifici HDP (principalmente LL-37 umano e suoi ortologhi di primati, e le bactenecine degli artiodattili) modificandone razionalmente le sequenze e/o identificando frammenti attivi, per poi studiare la capacità di interagire e alterare le membrane biologiche e la modalità con cui questo avviene, oppure la capacità di internalizzare e colpire obiettivi interni.

A tal fine, utilizziamo un'ampia gamma di metodi biofisici e biochimici, quali studi spettroscopici con CD e fluorescenza (allo stato stazionario o risolta nel tempo), risonanza plasmonica di superficie, citometria a flusso e vari tipi di test per definire l’attività antimicrobica.

(A. Tossi, S. Pacor in collaborazione con M. Benincasa, P. Cescutti e C. Lagatolla)

Progetto 3. Ridisegno razionale e ottimizzazione degli HDP

Si ritiene che gli HDP abbiano un elevato potenziale quali lead-compound per lo sviluppo di agenti anti-infettivi, sia per applicazioni biomediche che per altre applicazioni. Ciò è dovuto anche alla loro notevole attività contro ceppi multi-resistenti agli antibiotici convenzinali, e ad una tendenza relativamente bassa di suscitare a loro volta resistenza. Tuttavia, sono poco adatti per l'uso sistemico a causa di difficoltà di produzione, bassa biodisponibilità e indici terapeutici insufficienti. La razionale modifica delle loro sequenze e strutture può tuttavia aumentare il loro potenziale per specifici usi terapeutici:

- L'ottimizzazione delle dimensioni e delle caratteristiche chimico-fisiche possono consentirne un’applicazione economicamente conveniente per trattamenti topici delle infezioni o per prevenire la contaminazione di dispositivi biomedici

- La funzionalizzazione delle bactenecine, HDP poco tossici e ad azione interna, può consentirne l’utilizzo come agenti veicolanti per antibiotici poco permeanti nei batteri

- la coniugazione di HDP o loro derivati ​​a nanocostrutti di diverso tipo può aumentarne la stabilità e tempo di vita in vivo, ridurne la citotossicità e permettere una migliore distribuzione ai siti d’infezione.

L'implementazione delle modifiche beneficia delle conoscenze raccolte sulle caratteristiche funzionali degli HDP e dati di SAR ottenuti negli altri progetti del gruppo, e da una lunga esperienza con la sintesi in fase solida, modificazione e coniugazione dei peptidi.

(A. Tossi, S. Pacor, F. Guida in collaborazione con M. Scocchi, M. Benincasa e M. Mardirossian)