Il programma di ricerca coordinato è incentrato sugli aspetti sia di base che traslazionali della farmacologia degli immunosoppressori e dei farmaci antileucemici. Gli interessi di ricerca del team sono focalizzati sull'individuazione e lo studio delle caratteristiche molecolari e cellulari che possono essere utilizzate per personalizzare la terapia immunosoppressiva e antileucemica nei pazienti pediatrici. Con una combinazione di approcci farmacocinetici, farmacodinamici e farmacogenomici, il gruppo studia il ruolo e l'interconnessione di queste caratteristiche e la loro associazione con la risposta dei pazienti alla terapia.

Al centro delle indagini è la personalizzazione della terapia per la malattia infiammatoria intestinale pediatrica, la leucemia linfoblastica acuta, la sindrome nefrosica e l'artrite idiopatica giovanile, con particolare attenzione ai farmaci utilizzati in queste malattie.

Approcci farmacologici per la personalizzazione della terapia della malattia infiammatoria intestinale pediatrica (MICI)

Le MICI sono caratterizzate da un'infiammazione idiopatica cronica intestinale e comprende due principali disturbi: malattia di Crohn e colite ulcerosa. Il picco di insorgenza di MICI è nelle persone di età compresa tra 15 e 30 anni; tuttavia, l'insorgenza della malattia nei pazienti pediatrici è frequente e un aumento dei tassi di incidenza a livello globale (in particolare della malattia di Crohn) sono stati dimostrati sia nei paesi sviluppati che in via di sviluppo, costituendo una vera epidemia nei bambini. Nonostante l'introduzione in terapia di agenti biologici altamente efficaci, come l’inibitore del TNF-alfa, infilixmab, i glucocorticoidi e le tiopurine (azatioprina) sono ancora impiegati rispettivamente per indurre e mantenere la remissione nelle MICI da moderate a gravi, ma notevoli differenze interindividuali nella loro efficacia e tossicità sono state segnalate. In particolare per i glucocorticoidi, l'efficacia di questi farmaci è molto variabile e gli effetti collaterali, particolarmente gravi nei pazienti pediatrici, sono comuni e spesso imprevedibili: la comprensione della regolazione genica complessa mediata dai glucocorticoidi potrebbe far luce sulle cause di questa variabilità.

In questo contesto, i microRNA (miRNA) rappresentano un nuovo e promettente campo di ricerca. Il progetto mira a identificare le associazioni tra i profili di espressione genica (espressione di mRNA e miRNA e loro combinazioni) e i fenotipi farmacologici considerati (cioè la risposta glucocorticoide in vivo e in vitro) nei pazienti pediatrici con IBD.

Per l'azatioprina, la ricerca attuale considera la concentrazione di metaboliti tiopurinici nei bambini con IBD e la associa con polimorfismi in determinanti candidati della biotrasformazione tiopurina, come tiopurina-S-metil transferasi (TPMT), inosina-trifosfato-pirofosfatasi (ITPA) e glutatione- S-transferasi (GST). Particolare attenzione viene posta sugli aspetti di sviluppo della biotrasformazione tiopurina durante la crescita dei pazienti.

La terapia biologica con antagonisti del TNF-alfa come l'infliximab ha migliorato significativamente la gestione clinica dei pazienti pediatrici con IBD grave: sono in corso studi per monitorare il trattamento con infliximab con approcci farmacocinetici e farmacodinamici per ottimizzare ulteriormente e razionalizzare la terapia con infliximab nei bambini che hanno bisogno di questi farmaci costosi. Le informazioni attese ottenute da questi studi traslazionali saranno estremamente utili per ottimizzare la terapia, migliorare i tassi di cura e ridurre gli effetti collaterali.

Approcci farmacologici per la personalizzazione della terapia della leucemia linfoblastica acuta (LLA)

I protocolli polichemioterapici adattati al rischio curano con successo l'85% dei pazienti con LLA, la più frequente neoplasia ematologica dell'infanzia. Oltre a questa importante percentuale di successo, la terapia della LLA è complicata da variazioni interindividuali, attualmente imprevedibili, nella risposta clinica. Infatti, tra i pazienti che ricadono, il 50-70% deve affrontare un esito fatale; inoltre, la maggior parte dei pazienti sviluppa tossicità correlate alla chemioterapia gravi o addirittura letali. Uno studio prospettico multicentrico, focalizzato principalmente sugli antimetaboliti metotressato e sulla mercaptopurina impiegati nel protocollo polichemioterapico della LLA. Questo studio è condotto su pazienti arruolati nell'attuale protocollo AIEOP-BFM (Associazione Italiana Ematologia e Oncologia Pediatrica - Berlin Frankfurt Munchen) ALL 2009 e intende integrare diverse misurazioni farmacologiche (farmacogenetiche, farmacocinetiche e farmacodinamiche) con la loro risposta alla terapia, con lo scopo di fornire ai medici gli strumenti per adattare al meglio il trattamento alle caratteristiche individuali dei pazienti. Le variabili farmacogenomiche considerate sono polimorfismi a singolo nucleotide nei geni coinvolti nella biotrasformazione della mercaptopurina (TPMT, ITPA, PACSIN2), nel gene SLCO1B1 coinvolto nell’escrezione del metotressato e nelle delezioni di GST-M1 e GST-T1, importanti per la detossificazione di diversi farmaci. Le varianti di interesse sono anche esaminate retrospettivamente in pazienti arruolati nel precedente protocollo AIEOP-BFM ALL 2000 il cui DNA e dati clinici sono già disponibili. Le misurazioni di farmacocinetica comprendono la clearance del metotrexato durante la fase di consolidamento e la valutazione dei principali metaboliti attivi di MP (nucleotidi di tioguanina e metilmercaptopurina nucleotide metilata) nonché dell'attività enzimatica di TPMT e ITPA, monitorata durante il consolidamento e la terapia di mantenimento. I parametri farmacodinamici sono forniti dal test MTT in vitro sulle esplosioni alla diagnosi che misura gli effetti citotossici dei farmaci antileucemici. Le analisi statistiche valutano l'associazione tra i parametri farmacologici in vitro dei pazienti e la risposta in vivo, per verificare il ruolo prognostico sull'esito clinico.

Approcci farmacologici per la personalizzazione della terapia della sindrome nefrosica (SN)

SN è una comune malattia renale infantile causata da una compromissione della funzione glomerulare che si presenta tipicamente nella prima decade di vita. Gli steroidi sono considerati la terapia di prima linea della SN infantile idiopatica e sono in grado di indurre la remissione nel 90-95% dei pazienti. La reattività degli steroidi alla diagnosi è di grande importanza prognostica per quanto riguarda la funzionalità renale, che è generalmente ben conservata nelle SN sensibili agli steroidi. Casi di SN resistenti agli steroidi, primarie e secondarie, sono osservate rispettivamente nel 5-10% e nell'1-3% dei bambini e quei pazienti sono soggetti a malattia progressiva e insufficienza renale. Anche le recidive sono comuni nei bambini; i pazienti pediatrici con malattia recidivante sono a rischio di gravi complicazioni.

Sono stati fatti molti sforzi per prevedere la risposta ai glucocorticoidi nei bambini con SN per evitare terapie farmacologiche inutili ed effetti collaterali, ma con risultati contrastanti.

L'obiettivo principale di questa ricerca è la valutazione del ruolo dei polimorfismi dei geni coinvolti nella farmacocinetica e farmacodinamica dei glucocorticoidi nella risposta alla terapia steroidea nei pazienti pediatrici con SN trattati con un protocollo standardizzato e l'identificazione di marcatori genetici utili, che permettano di prevedere a priori l'efficacia e della terapia steroidea.

Gli obiettivi secondari sono: verificare le possibili relazioni tra la presenza dei polimorfismi indagati e l'insorgenza di effetti collaterali (effetti sulla crescita, pressione sanguigna, ecc.), testare il ruolo dei polimorfismi su possibili cambiamenti nel comportamento e nella qualità della vita, valutati mediante questionari di autovalutazione, in individui con SNI dopo il trattamento con steroidi e infine verificare le possibili relazioni tra polimorfismi genetici e risposta ai glucocorticoidi in vitro (test di proliferazione delle cellule mononucleate).

Approcci farmacologici per la personalizzazione della terapia dell'artrite idiopatica giovanile (AIG)

Per i bambini con AIG che non rispondono al metotrexato, il ritardo nell'identificazione del trattamento ottimale in uno stadio precoce della malattia può portare a danni articolari a lungo termine. Studi recenti indicano che le varianti geniche più rilevanti per predire la risposta del metotrexato in AIG sono quelle in 5-aminoimmidazolo-4-carbossamide-ribonucleotide-trasformylase (ATIC), inosina-trifosfato-pirofosfatasi (ITPA) ed il trasportatore SLC19A1. Lo scopo dello studio è quindi quello di esplorare il ruolo di questi fattori genetici candidati sulla risposta al metotrexato in una coorte italiana di bambini con AIG. La risposta clinica al metotrexato viene valutata come valori di attività della malattia (valori e cambiamenti di JADAS e ACRped) e come remissione clinica stabile per un periodo di 6 mesi. Gli SNP più rilevanti per ciascun gene considerato sono saggiati sul DNA dei pazienti. L'attività dell'ITPA e la concentrazione dei metaboliti attivi di farmaco, metotressato poliglutammati sono misurate negli eritrociti dei pazienti.

L'obiettivo primario è quindi identificare i marcatori farmacogenetici e farmacocinetici utili nel predire l'efficacia del metotrexato in pazienti con AIG. Infatti, l'identificazione di pazienti che potrebbero rispondere al metotrexato prima del trattamento dell’AIG sarebbe molto utile per il clinico ed il nostro studio dovrebbe supportare lo sviluppo di profili farmacogenetici multilocus per predire la risposta al metotrexato in questi pazienti. La genotipizzazione deve essere eseguita alla diagnosi ed i pazienti con un genotipo che predispone alla risposta potrebbero essere trattati con metotrexato, data l'alta probabilità di risposta a questo trattamento. Questo studio fornisce un razionale per riservare i farmaci biologici ai pazienti che probabilmente non beneficeranno di trattamenti meno costosi ma comunque efficaci come il metotrexato. Al contrario, i pazienti con varianti associate alla mancanza di efficacia del metotrexato, dovrebbero essere trasferiti più rapidamente ad un trattamento più aggressivo (cioè, metotrexato + biologi o biologici da soli).

Studi meccanicistici in vitro sulla farmacocinetica, la farmacodinamica e la farmacogenomica dei glucocorticoidi e degli antimetaboliti

Le ipotesi molecolari generate sulla base delle osservazioni fatte nei pazienti sono verificate in vitro, per ottenere informazioni sui meccanismi cellulari e molecolari alla base dei fenomeni clinici rilevanti e per migliorare ulteriormente la pratica clinica.

Attualmente, questi esperimenti in vitro sono focalizzati su:

- identificazione di long non coding RNA come potenziali marcatori coinvolti nel meccanismo molecolare dei glucocorticoidi, fornendo così una nuova valutazione del loro coinvolgimento nel fenomeno della resistenza agli steroidi; uno scopo importante di questa ricerca è quello di fornire uno strumento che potrebbe consentire l'ottimizzazione della terapia steroidea nei pazienti trattati con questi farmaci;

- sviluppo di un modello biotecnologico per studiare gli effetti delle tiopurine in vitro ed il contributo dei determinanti genetici nella modulazione degli effetti citotossici e della biotrasformazione degli antimetaboliti, con particolare attenzione agli eventi che si verificano in tessuti intestinali, epatici e pancreatici: questo modello potrebbe quindi essere impiegato per validare il ruolo dei fattori genetici (emergenti anche dagli studi sull'intero genoma) sulla sensibilità dei pazienti alle tiopurine e per valutare gli effetti degli aggiustamenti del trattamento;

- sviluppo di modelli farmacologici innovativi basati sulle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC): si tratta di cellule staminali ottenute riprogrammando le cellule somatiche in uno stato simile all'embrione mediante l'espressione forzata di geni selezionati. La pluripotenza delle iPSC consente di ottenere linee cellulari altrimenti non facilmente accessibili da soggetti umani, poiché possono essere differenziate in vari tipi di cellule, crescendo le iPSC in condizioni appropriate. I progressi nella tecnologia delle iPSC creano nuove possibilità per modellare le malattie e per controllare gli effetti avversi dei farmaci in un modo più personalizzato. Studi pionieristici sono stati condotti su cellule epatiche, cardiache e nervose. Tuttavia, attualmente, gli studi basati sulla tecnologia delle iPSC, sul pancreas esocrino e sulla pancreatite indotta da farmaci sono limitati e questo è il punto focale della nostra attuale ricerca in questo ambito.